海洋環境の現場モニタリング用のコンパクトで自動化された eDNA サンプラー

Jun 14, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5210 (2023) この記事を引用

2069 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

環境 DNA (eDNA) を使用して水生環境の生物多様性を監視することは、視覚的および音響的識別などの他の方法に代わる効率的かつコスト効率の高い代替手段になりつつあります。最近まで、eDNA サンプリングは主に手動サンプリング方法によって行われていました。しかし、技術の進歩により、サンプリングをより簡単かつアクセスしやすくする自動サンプラーが開発されています。この論文では、1 人で展開できる単一ユニット内で、セルフクリーニングと複数サンプルの捕捉と保存が可能な新しい eDNA サンプラーについて説明します。このサンプラーの最初の現場テストは、典型的なニスキンボトル回収および回収後の濾過方法を使用して採取された並行サンプルと並行して、カナダのノバスコシア州ベッドフォード盆地で行われました。どちらの方法でも同じ水生微生物群集を捕捉でき、代表的な DNA 配列の数は方法間でよく相関しており、R\(^{2}\) 値は 0.71 ～ 0.93 の範囲でした。 2 つの収集方法では、ほぼ同一の相対存在量で同じ上位 10 科が返され、サンプラーがニスキンと同じ一般的な微生物の群落構成を捕捉できたことが実証されました。提示された eDNA サンプラーは、手動サンプリング方法に代わる強力な代替手段を提供し、自律走行車の積載量の制約に適応し、遠隔地やアクセスできない場所の永続的な監視を容易にします。

水生環境における人間の活動の増加により、栄養負荷の増加によって引き起こされる低酸素症、海洋酸性化、富栄養化などの問題を引き起こす人為的影響に関する懸念が生じています1。これらの影響は、殻や骨格が酸性化の影響を受ける石灰化海洋種などの特定の生物の成長を妨げる可能性があり2、魚や人間の経済に害を及ぼす有害な藻類ブルーム（HAB）を引き起こす生物を含む他の生物種の成長を促進する可能性があります3。 4. これらの変化とその結果として生じる影響のタイムスケールは、数時間から数年にわたる場合があり、それぞれの生態系が固有であるため、変化を追跡するのが難しい場合があり、変化を適切に評価するには時間分解の現場観察が必要です。

生物学的モニタリングプログラムは伝統的に、対象となる重要な分類群を手動で特定することに重点を置いてきました。ただし、これらのプログラムには時間がかかり、分類学的識別に関する特別なトレーニングが必要になる場合があります。近年、DNA 配列決定のコストの低下と核酸データベースのサイズの増大に伴い、環境 DNA (eDNA) が生物学的モニタリングプログラムにおける生物多様性の代用として使用されることが増えています5。 eDNA のモニタリングには、環境に存在するすべての DNA の研究が含まれます 6。これは、非侵襲的であり、高感度の DNA 抽出から固有のバーコード配列の検出まで、急速に進化する一連の分析手法を使用して微生物相と後生動物に同様に広く適用できるため、さまざまな点で利点があります 7。植物プランクトンによる一次生産や死んだ有機物の生物地球化学的循環におけるeDNAの役割の重要性を考慮して、微生物の多様性を研究するためのeDNAの価値を実証した研究は数多くあります。例えば、水産養殖環境における微生物叢のバイオモニタリングは、環境撹乱に対する微生物の急速な反応を検出し、持続可能な水産養殖産業のための管理戦略を評価するための eDNA の有用性を実証しています 8,9,10。さらに、eDNA が魚類の生物多様性の環境モニタリング 11、海洋哺乳類の追跡 12、および保全生物学のその他の側面において重要な役割を果たす運命にあることを実証する研究の数が増えています 13。

現在の eDNA サンプリング方法は多くの場合、労働集約的であり、ニスキンボトルまたは同様の機器を使用してサンプルを収集し、その後に別々の濾過と保存のステップが行われ、多くの場合、それぞれ蠕動ポンプと冷凍庫が使用されます。 eDNA のサンプリングと分析の手動コンポーネントにより、遠隔環境や定期的にサンプルを採取する必要がある環境での使用が制限され、プロセスの実行には訓練を受けた担当者が必要になります。 eDNA 法の適用可能性をより困難な問題に拡張するには、自動サンプリング装置の開発を含む自動化が必要です。最近開発されたサンプラーは、単一フィルターシステムからより複雑なマルチフィルターシステムまで多岐にわたり、展開期間、最大深度定格、使用される化学物質/防腐剤などのパラメーターはそれぞれ異なります。市販されているものと研究用プロトタイプの両方を含む、現在の eDNA サンプラーの代表的なリストの概要を表 1 に示します。

最も先進的なものから始めて、環境サンプルプロセッサー (ESP) には 60 個ものフィルターカートリッジが収容されています。ただし、ESP サンプラーは、水産養殖業者による使用、都市港での展開、風力タービン設置などの商用ワークフローやアプリケーションに完全に移行することなく、主に研究研究に留まっています。このサンプラーは、先駆的な ESP の進化に基づいています。モントレー湾水族館研究所 (MBARI) によって開発された現場サンプラーおよび DNA 分析装置。これらの完全に水中分析装置は 2001 年から 2009 年にかけて開発され 24、第 1 世代および第 2 世代と呼ばれました。これらは、PCR マイクロ流体デバイス、ハイブリダイゼーションアレイ、およびサンドイッチアッセイに供給するサンプル収集と DNA 抽出を実行する総合的な海底実験室でした。ただし、ESP 第 1 世代および第 2 世代の機器は数十万ドルの費用がかかり、導入とサービスが非常に複雑で、通常、最終契約は数百万ドルになります。 MBARI の最新世代の機器である第 3 世代では、統合分析が完全に削除され、水中ビークル上で保存されたサンプル収集を実行し、その後陸上で実験室ゲノミクス分析を行うことを目的としています20。

ESP 第 3 世代ではコストと複雑さが軽減されましたが、新しい合理化されたサンプラーは、eDNA 用地下自動サンプラー (SASe)、PolyWAG (水獲得ゲノミクス)、CLAM など、in situ で eDNA を収集するためのスケーラビリティをさらに向上させることを目的としています。 (継続的な低レベル水生モニタリング)。これらのシステムの価格は数千ドルであるため、自動化された eDNA サンプリングがより利用しやすくなります。これらの合理化されたサンプラーのほとんどはフィルターが 1 つで、保存試薬や洗浄試薬を搭載しない傾向があり、短期間 (時間ごと、毎日) の導入に適しています。一部の製品は長期展開機能を備えていますが (SASe ユニットにはオンボード保存機能があります)、多くの製品には酸や漂白剤による自己洗浄機能がなく、生物付着や相互汚染を最小限に抑えるためにサンプル入口/吸入口をフラッシュする機能もありません。 PolyWAG システムは、空気を使用した自己洗浄機能とエタノールを使用した自己保存機能を備えた 24 個のフィルターを提供します。自動化の追加により、コストが 3,000 ～ 5,000 米ドルに増加します。さらに、これらの設計では、プラットフォームとの統合や自律走行車の積載制限に適したフォームファクターがほとんど考慮されておらず、場合によっては、露出したチューブや固定されていないワイヤや電子機器が使用されます。

(a) 電子セクションが部分的に露出した DOT eDNA サンプラーの 3D CAD レンダリング。 (b) DOT eDNA サンプラーの断面図。すべてのコンパートメント、液体保存バッグ、付属の蛍光光度計が強調表示されています。 (c) 水中に展開された完全に構築された DOT eDNA サンプラー。

ここでは、図 1 に示すように、革新的な設計を使用して水サンプルの収集、濾過、保存をすべて単一の機器内で行うことができる、新しい自律型 eDNA サンプラーを紹介します。このサンプラーは、展開ごとに最大 9 つの個別のサンプルを収集できます。他のサンプラーとは異なり、取り外し可能なカセットに保存されており、現場で 5 分以内に簡単に交換できます。これにより、機器の即時再展開が可能になり、新しいカセットを迅速にロードし、充填されたカセットを現場または研究室に戻して分析できます。さらに、ユニットは生物付着を防ぐために自己洗浄機能を備えており、展開中にラインに引っかかるのを防ぐためにすべてのチューブが機器のハウジングに含まれています。また、サンプラーはコンパクトで、2 つのハンドルを備えた設計になっているため、1 人で持ち運びや展開が可能です。このサンプラーは、カナダの Dartmouth Ocean Technologies Inc. を通じて購入できるようになっています。 eDNA サンプラーの初期市場価格は、機器本体が 55,000 米ドル、試薬、オプション、追加のフィルターカセットが 5000 ～ 10,000 米ドルです。ここでは、小型船舶からの実際の展開におけるサンプラーの初期テストについて説明します。ユーザー重視のサンプラー設計により、eDNA 収集の標準化と簡素化が可能となり、環境モニタリングにおけるサンプリングの信頼性と再現性が向上します。当社のサンプラーは、微生物群集レベルから個々の配列レベルまで、典型的なニスキンボトル捕捉および蠕動濾過法の使用を通じて得られた結果と一致させることができました。

ダルハウジー大学は、ダートマスオーシャンテクノロジーズ社 (DOT) と協力して、図 1 に示すように、フィルターカートリッジ、電子機器セクション、流体貯蔵セクションの 3 つの取り外し可能なセクションを備えたシンプルなモジュール式アプローチを特徴とする新しい eDNA サンプラーを作成しました。完全に組み立てられたユニットは長さ 72.1 cm、幅 16.8 cm、重量は空気中で 11.3 kg、海水中では 3.3 kg です。サンプル捕捉間の洗浄、捕捉されたサンプルの保存が可能で、それぞれ直径 25 mm の 9 つの個別フィルターが付いています。さまざまなフィルター膜をフィルターホルダー (Advantec 43303010、ポリプロピレン) に装填できるため、対象となる種に基づいてさまざまな膜材料と孔径を使用できます。 eDNA サンプラーのフィルターカートリッジはポリエーテルエーテルケトン (PEEK) 素材で作られており、9 つのフィルターホルダーを保持します。フィルターカートリッジにきれいなフィルターをロードしたら、eDNA サンプラーの電子セクションに取り付けることができます。この高速交換アプローチにより、複数のフィルターカートリッジを準備し、必要に応じてサンプラーにロードすることができます。フィルターカートリッジは、組み立てミスを避けるために、電子セクションにインデックスされた 3 つのノブによって固定されています。この論文で使用されているサンプラーのバージョンは、深度定格が 20 m です。ただし、3000 m バージョンも入手可能であり、ESL 研究所 (カナダ、ニューサウスウェールズ州ダートマス) の圧力チャンバーでのテストに成功しています。

eDNA サンプラーの電子セクションは機器の中核です。ポンプとカスタムバルブツリーに加え、自動化とデータロギング用のカスタムプリント基板 (PCB) が収容されています。 PCB とソフトウェアについては、以下の「システムアーキテクチャ」セクションで説明します。バルブツリーは、流体ルーティングマニホールド、圧力センサー、チューブ相互接続、サンプラー用のソレノイドバルブで構成されます。バルブツリーには、フィルターカートリッジ上のフィルターに流体的に接続し、試薬が充填されサンプラーの流体セクションに保管されている流体バッグにアクセスするために使用されるポートもあります。

eDNA サンプラーの液体保管セクションには、必要なすべての液体とオプションの蛍光光度計が収納され、保護されています。このセクションに保管される液体は次のとおりです: 5% 塩酸 (HCl) (洗浄)、RNAlater (保存)、精製 Milli-Q 水 (リンス)、および廃棄物。液体は 100 mL および 500 mL の Labtainer\(^{\textrm{TM}}\) BioProcess Containers (BPC) に保管され、1/4 ～ 28 ポートで電子機器セクションに接続されます。廃棄物バッグは、海や周囲の水域に流すのが安全ではないと考えられる化学物質を入れるために使用されます。 RNAlater は収集したサンプルの保存に使用され、5% HCl はシステム流体ラインの洗浄とサンプル入口の逆流に使用され、Milli-Q はプロトコルステップ間でシステムをフラッシュするために使用されます。 5% HCl と Milli-Q は、サンプリングイベントの間にシステムのチューブやマニホールドで発生する可能性のある相互汚染を減らすのに効果的です。この研究で使用した HCl と RNAlater は分析グレードのもので、Fisher Chemical (米国マサチューセッツ州ウォルサム) から供給されました。

eDNAサンプラーの流体概略図を図2に示します。eDNAサンプラーは、いくつかのソレノイドバルブ、フィルター膜、搭載化学物質、およびサンプル入口ポートと出口ポートを介した周囲の流体へのアクセスを特徴としています。 eDNA サンプラーは、ソレノイドバルブとシリンジポンプ間の動作を調整するために使用されるカスタム制御スクリプトを備えています。この調整により、流体をサンプラーのある場所から別の場所に移動させることができます。流体の移動は、蛍光計と圧力測定値の両方の監視と記録と同時に実行されます。カスタムスクリプトは、eDNA サンプラーのフラッシュメモリまたは SD カードストレージにプログラムすることも、端末を介して手動で入力してより詳細に制御することもできます。このペーパーで使用されたスクリプトは、サンプラーが初めてデプロイされるため、ユーザーの制御とデバッグの可視性を高めるために端末から手動で入力されたものです。カスタムスクリプトには、アクティブなバルブの数、収集量、時間制限、各ステップの最小流量を設定するサンプリングプロトコルが含まれています。

DOT eDNA サンプラーの流体概略図。サンプル微粒子の負荷に応じて、15 mL ～ 10 L 以上の水をろ過することにより、サンプルを計画的に収集するために 9 つのフィルターが使用されます。インライン圧力センサーを使用して膜間圧力を監視し、フィルター膜上の物質の蓄積を検出します。 RNAlater、5% HCL、および Milli-Q 水には、保存と洗浄に使用されるルーティングパスがあります。

(a) サンプルを捕捉して保存し、その後流体チャネルを洗浄するために使用されるプロトコル。 (b) ユーザーが指定した安全な動作領域 (F - 流量、P - 圧力、T - 時間、V - 容量) 内でプロトコルをロードして実行するために使用されるしきい値フロー図。 (c) 0.22 \(\upmu\)m ポリカーボネートフィルター膜のサンプリングプロセス中に取得された圧力データ。 * サンプリング時間は、プロトコルで指定された流量と流体の濁度によって異なります。上記の時間は、理想的な条件での 20 ml/min の場合です。

この論文で説明する展開に使用されるサンプリングプロトコルを図 3a に示します。各ステップの下に、推定完了時間が表示されます。「サンプルプライム」ステップでは、サンプリングプロトコルを開始し、内部チャネルを目的のサンプル流体でフラッシュすることによってサンプラーを準備します。その後、サンプラーは「サンプルキャプチャ」ステップを実行する準備が整います。このステップでは、サンプル流体をサンプル捕捉のために選択したフィルター膜 (M1 ～ M9) に押し込みます。フィルター上に収集された物質を保存するために、「RNAlater 保存」ステップでは、選択したフィルター膜に RNAlater を押し込みます。次に、「MQ フラッシュ」ステップでは、Milli-Q を使用して RNAlater をシステムからフラッシュし、次のステップで使用される 5% HCl との接触を回避します。「酸洗浄」ステップでは、5% HCl を使用してサンプラーの内部流体チャネルの汚染物質を洗浄します。次に、「MQ フラッシュ」ステップでは、Milli-Q を使用してチャネルから 5% HCl をフラッシュします。このプロセスでは、サンプラーをクリーンアップし、次のサンプルキャプチャの準備をします。サンプル注入口から酸を逆流させた後、サンプル注入口付近に残留酸が残る可能性があります。ただし、酸のバックフラッシュ後、デフォルトのプロトコルでは、サンプル入口に 9 ml の Milli-Q を押し込み、ラインと酸の入口をフラッシュします。これにより、希 5% HCl がサンプル入口からさらに遠ざけられ、次のサンプリングイベントの前に対流によって局所的な酸が除去されます。この展開では、酸フラッシュはサンプルイベントの最後に行われ、連続するサンプルの間には最低 30 分の時間が使用されました。将来的には、HCL が捕捉前に環境内のサンプルを消化する偽陰性を防ぐために、低流量または停滞水のプロトコルに最小待機期間が追加される可能性があります。

図 3b に示すアルゴリズムは、サンプルキャプチャがトリガーされるたびに実行されます。このアルゴリズムは、サンプリングプロトコルに示されている手順を実行し、量、圧力、時間を監視して、サンプラーが許容可能な実行条件内にあることを確認します。アルゴリズムは、一連のチェックを実行することから始まります。最初のチェックは、システム内の圧力が事前に設定された圧力制限を超えていないかどうかを判断することです。圧力がその制限を超えると、システムは事前に設定された 40% だけ流量を減らします。この後、システムはプロトコルステップの開始からの流量、経過時間、および体積をチェックします。いずれかの制限を超えると、サンプラーはスクリプトの次のステップに進みます。この手順は、サンプリングプロトコルに残りのステップがなくなるまで繰り返されます。その後、サンプラーは低電力状態に入り、サンプリングプロトコルを再度トリガーするための割り込みを待ちます。図 3c は、図 3a に示すサンプリングプロトコルが実行された最近の eDNA サンプラー導入の圧力プロファイルを示しています。

サンプラーは、サンプルスケジュールでプログラムされた後、人間やユーザーの介入を必要とせずにすべての機能を実行できるため、自律的です。この機能には、サンプルの捕捉、自動洗浄、およびサンプルの保存が含まれます。人間が行う唯一の操作は、スケジューラーのプログラミングに加えて、フィルターカートリッジ、化学薬品、バッテリーの交換です。 eDNA サンプラーには、スケジュールされたトリガー以外にも、外部センサーやコンピューター (AUV 後部座席システムなど) からトリガーできるオンボード 32 ビットプロセッサーが含まれています。

eDNAサンプラーのシステムアーキテクチャを図4aに示します。図 4b は、eDNA サンプラー用に完全に構築された PCB を示しています。サブコンポーネントの電気要件はさまざまであるため、システムには 3.3 ～ 12 VDC の範囲の複数の電圧を生成するレギュレータがあり、すべてバッテリまたは 7 ～ 24 VDC の電源入力によって供給されます。幅広い電圧入力により、配備に使用されるプラットフォーム (UAV/USV、ブイ、係留所など) に柔軟性が与えられます。このシステムは、84 MHz で動作する ARM Cortex M4 マイクロコントローラ (STM32F411) を使用して制御され、正確なタイミングを確保するために複数の割り込みと低レベル制御によって制御されるリアルタイムシステム (RTS) として構成されます。単一のマイクロコントローラーがシリンジポンプ、データロギング、通信、プロトコルの実行を管理します。シリンジポンプ (Lee Company Ltd. の LPDA1750330H の耐酸性カスタムバージョン) には、ステッピングモータードライバー回路 (DRV8834、Texas Instruments) と光学式直交エンコーダーが搭載されており、使用量の正確な追跡を支援します。システムで使用される 26 個のソレノイドバルブは、過剰な電流負荷なしで 32 個のバルブに電力を供給できるスパイクアンドホールド回路 (DRV8860、Texas Instruments) によって駆動されます。 DRV8860 はシリアル接続可能なデバイスで、システムで使用できるソレノイドを拡張するためのモジュラー設計が可能です。 eDNA サンプラーは、内蔵プログラマブルゲインアンプ (PGA) を備えたホイートストンブリッジ構成で圧力センサーを読み取ることができる 16 ビット ADC (ADS1115、Texas Instruments) モジュールを利用します。増幅された信号により、膜間差圧測定値を読み取ることができ、膜がメーカーの仕様内 (通常は 4 bar、60 psi 未満) で使用されていることを確認できます。オプションの圧力センサーを追加して、環境の周囲圧力とサンプラーの深さを読み取ることができます。サンプラーは、すべてのデータをタイムスタンプ付きのファイルとフォルダーとともに内部 32 GB microSD カードに保存します。ユーザーは、Bluetooth (スマートフォンアプリケーション経由) および/または RS-232 およびパーソナルコンピュータ端末を通じて eDNA サンプラーとインターフェイスします。これらはどちらも操作コマンドをサンプラーに送信できるようにするとともに、システムとの間でデータを転送するための経路としても機能します。たとえば、リアルタイムクロック (RTC) を介してスケジュールされたサンプリング時間を設定したり、膜/サンプルごとに圧力や蛍光計のデータを取得したりできます。システムはアイドル時に 1 W を消費しますが、サンプリング中にはピークで 10 W を消費します。

(a) STM32F411 マイクロプロセッサに基づく、内部の電気接続とコンポーネント、および外部世界へのインターフェイスを示す DOT eDNA サンプラーのアーキテクチャ図。 (b) 表面実装コンポーネントを備えた設計された PCB の正面図。

この研究で説明されている展開では、eDNA サンプラーはバッテリーから電力を供給されました。単一のバッテリーパック、561.6 Wh 塩化チオニルリチウムは、配備期間全体にわたって持続しました。バッテリーは、膜の詰まりがないと仮定して、最大 33.7 L のポンピングをサポートできます。これは、1 回の捕捉あたり 1 L、平均流量 10 mL/min で 32 回のフィルター捕捉に十分なはずです。ポンプは eDNA サンプラーで最も多くの電力を消費するため (8 W、ピーク時の電力バジェットの 80 %)、ポンプで送られるリットルは、バッテリー寿命の予想を示すのに最も適切な指標です。これらの仮定は、サンプリング時の水の濁度/粒子負荷にも依存します。標準試薬リザーバーはフィルターカートリッジ 1 個 (フィルターキャプチャ 9 個) に適しているため、現在、バッテリーや電力消費以外に液体が継続使用の制限要因となっていますが、3 個のフィルターカートリッジ (フィルター 27 個) をサポートする拡張液体容量バージョンも計画されています。キャプチャ）。

このデモンストレーションには外部電源は必要ありませんでしたが、eDNA サンプラーは一般的な 7 ～ 24 V DC 電源から電力を供給することもできます。電力は 6 ピンサブコンケーブルを介して供給され、車両またはプラットフォームから供給できます。 eDNA サンプラーの低消費電力 (ピーク 10 W) を考慮すると、このサンプラーは、ほとんどの自動運転車や太陽光発電のブイや設備で利用可能なホテル負荷に非常に適しています。

この eDNA サンプラーがその場でどのように機能するかの最初のテストとして、図 5 に示すように、ハリファックス港からベッドフォード盆地へのトランセクト中にサンプラーが配備されました。サンプリングは、ベッドフォード盆地のこのトランセクトの一連のステーションに沿って実施されました。、各ステーションが 1 回サンプリングされました。各ステーションでは、ユニットが深さ 5 m に展開され、スクリプトの最初の部分が実行されました。そこでは、125 mL の水の単一サンプルが直径 25 mm、0.22 \(\upmu\)m のポリカーボネート (PC) を通してろ過されました。膜（ミリポア）。サンプラーはボートがステーションにある間ずっと (15 ～ 17 分間) 展開され、125 mL が完全に捕捉されました。サンプラーをデッキに戻した後、スクリプトの 2 番目の部分が実行され、保存のために 6 mL の RNAlater が膜全体にポンプで送られ、「Acid Clean」ステップが実行されました。ステーションの保守には時間の制約があるため、この 2 段階のアプローチが実装されました。ただし、サンプラーが意図したとおりに、人間の介入なしに展開されている場合、両方の手順を組み合わせるのは簡単です。サンプルをカセット内の RNAlater に一晩保存した後、サンプルと 35 \(\upmu\)m プレフィルターを取り外し、-20 \(^{\circ }\)C の冷凍庫で短期間保存しました。 DNA を抽出する前に、-80 \(^{\circ }\)C の冷凍庫で長期間保管します。サンプラーは RNAlater を使用してサンプルを自動的に保存しますが、トランセクトと DNA 抽出の間のタイムラインが不明であるため、フィルターは長期保存の推奨に従って凍結されました。この導入では、サンプラーの入口に 35 \(\upmu\)m のプレフィルターが組み込まれました。この入口フィルターが追加されたのは、現在の設定ではバルブが 35 \(\upmu\)m を超える粒子に対して定格されていないためです。プレフィルターにより、サンプラーは細胞サイズが 35 \(\upmu\)m 未満の微生物を研究する用途に限定される場合があります。現在、より大きな 100 \(\upmu\)m プレフィルターを使用してシステムのパフォーマンスを調査しています。

ハリファックス港のサンプリング場所の地図。ステーションには順番に番号が付けられ、S1 が最初、S6 が最後になります。 S3 と S4 のサンプルは、同じ場所で約 2 時間離れて採取されました。積み上げ棒グラフは、すべてのサンプルの各サンプリングステーションで比較的豊富な細菌分類学的ファミリーの上位 10 位を強調表示します。上位 10 ファミリ内にないすべての ASV は「その他」として表されます。ここで示すマップは、GADM データ (バージョン 3.6)48 と R パッケージ ggplot239 および ggsn49 を使用して RStudio36 で作成されました。

ハリファックス港のサンプリング場所の地図。ステーションには順番に番号が付けられ、S1 が最初、S6 が最後になります。 S3 と S4 のサンプルは、同じ場所で約 2 時間離れて採取されました。各サンプルで比較的豊富な葉緑体 16S rRNA ASV の上位 10 個を特定することにより、積み上げ棒プロットを作成しました。 ASV は可能な限り低い分類ランクまで識別され、同じ分類を持つ ASV はさらに「ASV 1」から「ASV 3」として区別されます。「シアノバクテリア ASV 1」とラベル付けされている凡例の最初の ASV は、プレフィルターからも回収された唯一の ASV です。ここで示すマップは、GADM データ (バージョン 3.6)48 と R パッケージ ggplot239 および ggsn49 を使用して RStudio36 で作成されました。

ロープに取り付けた 5 L ニスキンボトルを使用して、各ステーションで同時にボトルのサンプルを同時に深さから採取しました。各ステーションでは、サンプラーのすぐ隣で水サンプルを採取するためにニスキンが配備されました。次に、この水サンプルを 2 つのボトルに分割し、どちらも甲板上でペリスタポンプを使用して直径 47 mm、0.22 \(\upmu\)m の PC 膜 (Millipore) を通してろ過し、ニスキンの各展開からフィルターを 2 つ作成しました。各複製について 660 ～ 1140 mL の水を濾過し、その後濾過した体積を記録し、液体窒素を充填したクライオシッパー内で膜を直ちに凍結しました。

すべてのサンプラーフィルターからの DNA と各ステーションからの 1 つの Niskin 複製が抽出され、処理されました。他のニスキンサンプルはアーカイブされ、抽出や配列決定に問題があった場合に備えてバックアップとして -80 \(^{\circ }\)C で保存されました。 Qiagen DNeasy plant mini kit を使用して、Zorz et al.25 に基づいて以下の追加の変更を加えた修正プロトコールを使用して、すべてのサンプルから DNA を抽出しました。サンプルは 52 \(^{\circ }\)C で 1 時間インキュベートし、同じ 50 \(\upmu\)l の Qiagen 製溶出バッファー (AE バッファー) を使用して DNA を 2 回溶出し、DNA 濃度が最大に抽出されるようにしました。抽出後、各サンプルからの 10 \(\upmu\)l の DNA が、ダルハウジー大学の Integrated Microbiome Resource Lab (IMR) での Illumina シークエンシングのために送られました。 Comeau et al.26 に概説されているアンプリコン配列決定のための IMR 標準操作手順に従って、16S リボソーム RNA 遺伝子の V4 ～ V5 領域の DNA 配列を決定しました。 16S アンプリコン断片は、融合プライマー (Illumina アダプター + インデックス + 特定領域) 515F = 5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3' および 926R = 5'-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3'27,28 を使用した 1 ラウンドの PCR を使用して二重に増幅しました。

配列は、QIIME2 2019.729 を使用して IMR26 によって開発された Microbiome Helper に従って処理されました。 Deblur (QIIME2 プラグインバージョン 2019.7)30 は、配列のノイズを除去し、個々のアンプリコン配列バリアント (ASV) を識別してラベル付けするために使用されました 31。 ASV は、単一の均質な単位として扱われる、関連性の高い DNA 配列のクラスターです。それぞれが種などの特定の分類グループに割り当てられ、複数の ASV が同じグループにマッピングされる可能性があります。同定後、葉緑体配列をさらに分類するために、SILVA 132 データベース 32,33 および PhytoREF データベース 34 を使用して ASV を分類しました。このデータから 2 つの ASV テーブルが作成されました。1 つは生の ASV 数を示し、もう 1 つはサンプル間の相対存在量を比較できるように生の ASV 数を 4000 に減らした表です。レアファクションは、異なるサイズのサンプルを正規化されたしきい値までサブサンプリングする正規化プロセスです35。図S2の希薄化曲線はサポート情報にあります。すべてのプロットは、UpSetR37、Phyloseq38、ggplot239、および ggpmisc40 のパッケージを使用して RStudio36 を使用して作成されました。

eDNA サンプラーの最初のフィールド展開では、合計 6 つのステーションがサンプリングされました。サンプルが採取された座標と時刻は表 S1 にあります。サンプリングされたステーションのマップを図 5 に示します。6 つのステーションのうち 2 つ (S2 と S6) では、事前に設定した目標ボリュームに達しませんでした。これは、膜貫通圧力が閾値に達し、フィルター膜をブロックするのに十分な物質が蓄積したためであり、したがって、ステーション上に滞在する時間閾値が体積閾値に達する前に満たされたためである。表 2 に示すように、残りのステーション S1、S3、S4、および S5 ではサンプルが 100% 捕捉されました。表 2 は、各トランセクトサンプルおよびプレフィルターの抽出された DNA および生の配列決定データに関するさまざまなメトリクスの概要を示しています。サンプラーを使用して収集したサンプルでは溶出 DNA 濃度が低かったものの、濾過量の違いを考慮すると、元のソース DNA 濃度 (つまり海水) はニスキンとサンプラーで同等ですが、DNA 抽出の効率が 100% ではないため同一ではありません。。同様に、プレフィルターの溶出 DNA 濃度は低く、元のサンプルではほぼ 0 ng/mL でした。

図5は、両方の収集方法の各ステーションで相対存在量が最も高い10家族を示しており、図S1にも並べて示されています。 2 つの収集方法では、ほぼ同一の相対的存在量で同じトップファミリーが返され、サンプラーがニスキンと同じ一般的な微生物の群落構成を捕捉できたことが実証されました。最も豊富な 10 科すべてが 12 サンプルすべてで見つかり、ロドバクテリア科は 6 観測点のうち 5 つでニスキンとサンプラーの間で相対存在数の差が最も大きく (S1 で 9%、S3 ～ S6 で 5%)、フラボバクテリア科は最大の差は S2 (6%) です。各観測点における他のすべての分類群間の差異は、バークホルデリア科を除いて 5% 未満でした。 Burkholderiaceae 科は、サイト S1 (サンプラー: 10%、ニスキン: 2%) で高い分散を示し、程度は低いですが S2 (サンプラー: 4%、ニスキン: 2%) でした。これは、Ralstonia picketti として分類される特定の ASV によるもので、すべてのサンプラーサンプルで検出されましたが、ニスキンサンプルでは検出されませんでした。図 6 の植物プランクトン群落の同様の分析では、S4 ニスキンのすべての葉緑体読み取り値の 30% から 60% までの範囲のすべてのステーションで、両方のサンプルタイプ (ニスキンとサンプラー) を支配する単一の葉緑体 ASV として存在するタラシオシラ目の強力なブルームが示されています。 S3ニスキンでは%。プレフィルターサンプルではタラシオシラ目の証拠は見つかりませんでした。プレフィルターで見つかった唯一の ASV (図 6 ではシアノバクテリアとして表示) は、残りのサンプルでは相対的に少ない量で見つかりました。

各収集方法からのサンプル内のすべての ASV の生の数を相互にプロットした散布図。単一の赤い点は、サンプラー内でのみ見つかる潜在的な汚染物質であるラルストニアピケッティの生の数を示します。 S1 から S6 まで、サンプラーの使用率が高まるにつれて汚染物質は減少します。これは、新しいサンプラーの組み立て後、汚染物質を除去するために完全に洗浄する必要があることを示しています。

Niskin と eDNA サンプラーの結果も、個々の ASV レベルで定量的に類似していました。図 7 は、各サイトにおけるサンプラー ASV とニスキン ASV (細菌および植物プランクトンの両方) 間の相関を示しています。 R\(^{2}\) 値の範囲は 0.71 ～ 0.93 で、後のステーションの R\(^{2}\) 値はステーション S1 および S2 よりも高くなります。前述の Ralstonia picketti ASV は赤で強調表示されており、S1 と S2 での数が多く (それぞれ総数の 7.5% と 2%)、ステーション S3 ～ S6 での存在数が低くなります (\(\le\) 全体の 1%)数）。図 S3 は、各メソッドのステーション 1 ～ 6 にわたる各 ASV の合計カウントの散布図を示しています。

各サンプルおよびプレフィルター (PF) の ASV のアップセットプロット。各列は、黒い点で示される発生パターンを持つ ASV の数と、関連するサンプルを示します。各サンプルに関連付けられた ASV の合計数が左側に表示されます。ここでは、3 つ以上の関連する ASV を持つサンプルのセットが示されていますが、1 回または 2 回だけ発生する ASV を返すサンプルの組み合わせは示されていません。

最後に、13 個のサンプラー、ニスキン、プレフィルターサンプルにわたる各 ASV の存在と非存在のパターンを調べました。最も一般的な存在/不在パターンには、プレフィルターサンプルでのみ見つかった 190 個の ASV が含まれていました (図 8)。ただし、これらの割合は 10% 未満です (すべてのサンプルから収集された 235,501 配列のうち 20,936 配列)。対照的に、プレフィルターと少なくとも 1 つの他のサンプルでは 65 個の ASV のみが見つかりました。これは、プレフィルターが水柱内の重要な ASV を濾過せず、代わりに独自の組成を持っていたことをさらに裏付けています。ベッドフォード盆地サンプルサイト 12 か所すべてで合計 124 匹の ASV が見つかり、そのうち 24 匹はプレフィルターからも回収されました。これらのうち、ベッドフォード盆地部位のみから回収された 100 個の ASV は 171,345 配列 (72.8%) を占め、すべてのサンプルから回収された 24 個の ASV は 23,341 配列 (回収された全配列の 10.0%) を占めました。 7 つを超える ASV では他の存在/不在パターンは示されず、パターンの大部分は ASV のプール内で 1 回または 2 回観察されました。これらの結果は、ステーション間のサンプルの均一性と、サンプラーとニスキンデータセット間の一貫性をさらに実証します。すべての eDNA サンプラーサンプルにわたって、合計 4,308 個の配列が汚染物質の可能性のある Ralstonia pickettii に割り当てられました。これらのカウントは、サンプル S1 の 4308 から最終サンプル S6 の 80 に減少しました。

この論文で示された結果は、新しい eDNA サンプラーの成功したテストと導入について詳しく説明します。同時のニスキンボトルサンプルと比較すると、サンプラーはすべてのステーションで細菌と植物プランクトンの両方についてほぼ同一の群集を捕捉しました。これは、ボリュームフィルタリングや時間分解能などのプロトコルの違いにもかかわらず、同様の結果を示した先行研究と一致しています42、43。 3G ESP を使用して実施された最近の研究でも、自律サンプリングと手動サンプリングの間で結果が同等であることが実証されました44。興味深いことに、ESP 研究ではサンプル量が逆転し、自律型サンプラーはより多くの量 (1 L) を濾過し、手動サンプリングではより少ない量 (36 ～ 100 mL) を濾過しました 44。私たちのプロトコルでは、自律サンプラーの量を減らしても同等の結果が得られたため、サンプリング時間を最小限に抑えることができました。

サンプラーとニスキン法のもう 1 つの違いは、ポンプとバルブの粒子制限により、サンプラーの入口に 35 \(\upmu\)m のプレフィルターが取り付けられていることです。ただし、ここでの結果は、サンプラーが依然として水柱内のコミュニティを捕捉したため、プレフィルターが結果に影響を及ぼさなかったことを示しています。プレフィルターを維持すると、サンプラーを小型で持ち運び可能なサイズに保つことができ、特にデッキスペースがほとんどない小型船舶での現場展開が容易になるため、有利です。また、プレフィルターは、洗浄プロトコルと入口からのバックフラッシュを含むプレサンプルフラッシュにより、詰まりによって結果に影響を与えることはなく、それによって物質がプレフィルターから押し出されました。

サンプル間の顕著な相違の 1 つは、ラルストニアピケッティとして分類された ASV がすべてのサンプラー結果で検出されたが、ニスキンの結果では検出されなかったことです。この細菌は環境中に一般的に存在し、プラスチック上で増殖する能力がある45。これは、以前の検査によるサンプラー内の汚染の一形態である可能性が高いことを意味します。この細菌の蔓延にもかかわらず、生の数と相対存在量はその後のサンプリングで急速に減少しました。これは、洗浄プロトコルが各サンプルのラインから細菌を除去していることを示しています。したがって、洗浄プロトコルを最適化することで、将来の汚染を防ぐことができます。

この研究では、ネガティブコントロールは使用されませんでした。これは、ニスキンボトルキャプチャが制御または比較メカニズムとして機能するためです。ただし、オンボードの Milli-Q リザーブをネガティブコントロールメカニズムとして利用するようにシステムを構成することもできます。試薬の量が制約ではないと仮定すると、操作モードの 1 つは、各サンプルの間に Milli-Q ブランクを入れること、または 5 つのサンプルと 4 つのブランクを設けることです。この欠点は、展開するたびに展開および交換する必要がある潜在的に大量の Milli-Q (ブランク/ネガティブコントロール) であることです。

この研究では、eDNA サンプラーとニスキンボトルキャプチャを使用して各部位が 1 回サンプリングされました。しかし、過去の出版物では、ベッドフォード盆地では細菌の組成が週単位で変化する可能性があることが実証されています46。 eDNAサンプラーの初期構成がうまく展開できることがわかったので、さまざまな水生環境における時系列研究により、人間の関与を最小限に抑えながら微生物の変化を洞察できるようになります。時系列研究以外にも、複数のサンプラーを反復的に展開して、機器間の再現性を評価することもできます。これらのタイプの調査はいずれも現在、2023 年から 2024 年に計画されており、数か月にわたって 6 台のサンプラーが導入される予定です。

サンプラーがサンプリング直後に核酸を保存するという利点を利用するために、将来の研究で eRNA を調べることもできるかもしれません。 RNAlater の優れたパフォーマンスが観察されましたが、サンプルの保存に Longmire のバッファー 47 や DNAgard\(\circledR\)16 などの他のソリューションを使用している研究室が多くあるため、保存用にさまざまな化学薬品をテストすることは有益です。

結論として、これらの結果は、洗浄と保存の両方が可能で、現場で交換可能なカートリッジを備えた新しい自律型 eDNA サンプラーのテストと展開が成功したことを示しています。これらの側面は、特に海洋保護区 (MPA) などの遠隔地や長期間にわたる研究や監視に有益です。システムの今後の研究には、クリーニングの最適化、蛍光光度計の統合、および複数の導入シナリオでのシステムの共同テストが含まれる予定です。全体として、この eDNA サンプラーはモニタリングプログラムでの eDNA の使用を拡大し、従来のサンプリング方法よりもアクセスしやすく便利になります。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、国立バイオテクノロジー情報センターのリポジトリ、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA917080 で入手できます。

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カナダの海洋スーパークラスター (OceanAware プロジェクト)、カナダ国立研究評議会の産業研究支援プログラム (NRC IRAP)、カナダ自然科学工学研究評議会 (NSERC) の発見助成プログラム、Mitacs 産業博士研究員フェローシッププログラム、オーシャンフロンティア研究所（OFI）およびカナダイノベーション財団（CFI）を通じたカナダファーストリサーチエクセレンス基金（CFREF）。私たちは、DNA 分析を支援してくれたジェニファー・トールマン博士と、彼女の港のトランセクトへの参加を許可してくれたルース・マスグレイブ教授に感謝します。 eDNA サンプラーのシャーシの設計と、この論文で使用する画像のレンダリングに貢献した Lee Miller 氏と Mark Wright 氏に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Andre Hendricks と Connor M. Mackie

ダルハウジー大学、電気およびコンピュータ工学科、ハリファックス、ニューサウスウェールズ州、カナダ

アンドレ・ヘンドリックス、コリン・ソンニクセン、ヴィンセント・ジーベン

Dartmouth Ocean Technologies Inc、ダートマス、ニューサウスウェールズ州、カナダ

コナー・M・マッキー、エドワード・ルイ、コリン・ソンニクセン、ジェームス・スミス、イアン・グルンドケ、アーノルド・ファーロング、ロバート・G・ベイコ、ジュリー・ラローシュ、ヴィンセント・ジーベン

ダルハウジー大学薬学部、ハリファックス、ニューサウスウェールズ州、カナダ

マタブ・タヴァソリ

ダルハウジー大学コンピューターサイエンス学部、ハリファックス、ニューサウスウェールズ州、カナダ

ロバート・G・ベイコ

ダルハウジー大学生物学部、ハリファックス、ニューサウスウェールズ州、カナダ

ジュリー・ラローシュ

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すべての著者は、機器の設計、製造、およびテストの側面に貢献しました。 AH、EL、CS が初期設計を作成し、AH と CM が実験作業の大部分を実行し、CM が JS の支援を受けてフィールドワークを実施し、IGIG が機械工学を担当しました。 AH と JS は電気工学を担当しました。 RB、CM、および JLR はゲノミクスデータ解析を実行しました。 MT、RB、AF、JLR、VS が資金を獲得し、プロジェクトを監督しました。著者全員が原稿を執筆、レビュー、編集しました。

Vincent Sieben への通信。

アーノルド・ファーロング、ジュリー・ラローシュ、マタブ・タヴァソリ、ロバート・ベイコ、ヴィンセント・ジーベンがDOT Inc.の株式保有を宣言。Connor Mackie、Edward Luy、Colin Sonnichsen、James Smith、Iain GrundkeはDOT Inc.に雇用されている。Andre HendricksはDOTに金銭的利害関係を持たない。株式会社

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Hendricks、A.、Mackie、CM、Luy、E. 他海洋環境の現場モニタリング用のコンパクトで自動化された eDNA サンプラー。 Sci Rep 13、5210 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-32310-3

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受信日: 2022 年 12 月 19 日

受理日: 2023 年 3 月 25 日

発行日: 2023 年 3 月 30 日

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